蛋白提取
大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液, 少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丁醇等有ji溶剂中,因些,可 采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。
(一)水溶液提取法
稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质常用的溶剂,通常用量是原材料体积的1-5倍,提取时需要均匀的搅拌,以利于蛋白质的溶解。提取的温度要视有效成份性质而定。转录组研究是基因功能及基因结构等研究的基础,通过新一代高通量测序,能够快速的获得某一物种特定组织或在某一状态下的几乎所有转录本序列信息,已广泛应用于临床诊断、基础研究和研发等领域。一方面,多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大,因此,温度高利于溶 解,缩短提取时间。但另一方面. ,温度升高会使蛋白质变性失活,因此,基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温( 5度以下)操作。为了避免蛋白质提以过程中的降解,可加入蛋白 水解酶抑zhi剂(如二yi丙基氟磷酸,碘yi酸等)。
单细胞RNA测序
单细胞RNA测序也称scRNA-Seq。通常而言,一般的组织细胞RNA-seq实验会产生1000万个读数,如果一个基因的频率超过50RPKM,即每百万读数中每千个碱基中超过50个,这一基因即被认为有表达。经过PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如纤维素薄膜或PVDF膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。泊松分布下,1kb长的基因有超过500个读数和4%的小变异系数,即CV值;哺乳动物细胞通产含有200,000个mRNA,因此至少要用50个单细胞一起才能到达小CV值;考虑到逆转录的效率和环境干扰等因素,为得到准确的表达和细胞种类的识别,需要使用的细胞数量实际要更多。
22.同样的OD用PAGE检测,EB染色为什么深浅不一?
答:通常可以用EB染色的方法来判断双链DNA的量(如质粒DNA),因为EB可以嵌合到双链DNA中。而合成的单链DNA,由于碱基组成不同,形成二级结构的可能性不同,EB的染色程度也会有差异,比如Oligo(dT)等不形成二级结构,EB染色效果就非常差。人体腺病毒已知有33种,分别命名为ad1-ad33,研究详细得是ad2。所以不要用EB染色的方法来定量,而用紫外分光光度计检测。同样道理,用EB染色来照片不适合所有引物。
23.引物不纯会有什么后果?
答:引物不纯可能会导致:1)非特异性扩增;2)无法用预先设计在引物5′端酶切位点的酶切开,特别是没有保护碱基的引物;3) 用于测序出现双峰或乱峰。解决办法重新合成或重新纯化。
24.已经溶解的引物,为什么原先使用正常,而过一段时间再使用就不好了?
答:如果溶解引物的水PH过低或污染了菌或核酸酶,会使引物降解。使用时没有充分解冻混合,液体不均匀也可能会造成引物加入量不准确。CmRNA相对表达量变化从图中可以扩增曲线可以看出目的RNA扩增效果,溶解曲线可以看出引物识别特异性情况,通过使用ΔΔCt方法计算可以得到每个组中目的mRNA表达变化。建议分装引物,避免反复冻溶。建议使用10mMT ris pH7.5缓冲液溶解引物,因为有些蒸馏水的pH值比较低(pH4-5), 引物在这种条件下不稳定。还有一种可能性是引物没有问题,而是PCR使用材料特别是模板的质量与先前使用的不完全一致。